iNature：基于序列特异性核酸酶的基因组编辑技术的出现及发展，正在彻底改变基础和应用生物学。特别是CRISPR-Cas9的发现及应用，基因组编辑技术已经广泛应用于植物基因组的编辑和作物的性状改良。基因编辑技术主要是通过在特定位点产生双链断裂（DSBs），进而通过差错率较高的非同源末端连接（NHEJ）的方式进行修复，在这个过程中会导致碱基的缺失或者插入，从而造成基因突变。通过基因编辑技术对植物中进行精确的基因替换或修饰在植物研究及应用中有更多的用途，也是目前植物编辑面临的挑战之一。将基因编辑技术应用于很难转化中的植物中也是一个重要的挑战。最近开发的Cas9变体（如cpf1），新型RNA指导的核酸酶，新型的碱基编辑系统，DNA-free的CRISPR-Cas9运输方法等为植物基因组编辑提供了巨大的机会。在这个综述文章中，高彩霞等描述了植物基因组编辑的现状，新开发的基因组编辑工具及其在植物中的潜在应用等，另外还讨论了植物基因组编辑面临的具体挑战及未来的发展前景。

在各种生物体进行靶向基因组编辑，正在引领着生物学的前进方向。基因组编辑使用序列特异性的核酸酶进行编辑，包括锌指核酸酶，转录激活子样效应子核酸酶和CRISPR-Cas系统。双链断裂（DSB）由这些序列特异性核酸酶产生的，通常通过非同源末端连接修复位点（NHEJ）或同源重组（HR）进行双链断裂的修复，导致基因敲除或基因替换。在CRISPR-Cas9系统和最近开发的CRISPR-Cpf1系统（对于细菌的免疫作用至关重要）中，内切核酸酶Cas9和Cpf1通过单链向导RNA（sgRNA）或crRNA以Watson-Crick碱基配对的方式被引导到特定基因组位点。由于其低成本，易于执行和高效率，CRISPR-Cas9系统已经成为最广泛采用的基因编辑系统，其被用在了越来越多的生物体中，包括各种植物，特别是一些主要作物种中【1】。

Fig.1 植物基因编辑的一般程序

在植物中，基于CRISPR-Cas9高效的基因组编辑，主要包括四个步骤（Fig.1  ）：首先，设计和构建特异性的sgRNA（step.1）。许多在线工具已经开发用于sgRNA设计【2】。但是，大规模的sgRNA设计用于植物筛选，还没有文章报道过； sgRNA的活性最好在原生质体验证（step.2），然后用于基因组编辑；此后，设计好了CRISPR-Cas9系统的组件转到植物细胞里面（step.3 ），通常是通过农杆菌介导的转化过程或基因枪方法，Cas9和sgRNA组件在植物基因组稳定整合；最后，通过聚合酶链反应（PCR）进行基因型鉴定（step.4）。

 CRISPR–Cas9组件运输到植物体

为了编辑植物基因组，必须将CRISPR-Cas9组件转运输到植物细胞。到目前为止，基因组编辑主要应用于可转化的植物。当前转化方法通常是物种类型特异性的，许多植物尚待建立起转化方法。此外，农杆菌被用于转化大多数植物，但这又为植物病原体的监管问题带来了隐患。因此，植物转化问题是植物基因组编辑主要瓶颈。解决DNA运输及植物转化问题进行了大量的研究：

·        过表达Baby boom (Bbm) 及 Wuschel2 (Wus2) 基因可以增加转化效率（高粱，玉米，水稻验证过【3】）；

·        瞬时表达CRISPR–Cas9 DNA 及 RNA：可用于难转染的植物，周期短，工作量小（小麦【4】）；

·        Cas9- mRNA 或者是 sgRNA的运输：效率低，但是不会整合到基因组里面，规避转基因的范畴；

·        Cas9- RNP的运输：只是在原生质体中有过报道，效率较低【5】。

CRISPR–Cas9系统在植物中脱靶问题

脱靶效应，其中Cas9切割基因组DNA位点是sgRNA的不完全互补的，导致切割了非目的基因片段，这是CRISPR-Cas9系统在人体细胞中应用的主要缺点。他们阻碍了CRISPR的潜在应用，特别是精确的进行基因组编辑，如基因治疗。脱靶效应可能不会对植物育种造成严重问题，正如传统的物理或者是化学方法进行诱变育种一样，也会产生一些其他的突变。但是这种问题可以通过回交来解决，虽然会减缓作物改良进度。此外，脱靶效应可能会引起监管部门的兴趣，限制其应用。

·        水稻检测脱靶效应，3个sgRNA靶向13个假想的位点，只出现了1个脱靶效应【6】；

·        小麦脱靶效率很低；Cas9-RNP导入的方法，脱靶很低【7】；

·        在植物中，没有系统的方法检测脱靶效应。

 CRISPR 系统类似物在植物中的基因编辑

CRISPR-Cas9方法进一步改进是必要的，特别是在PAM特异性和效率方面。植物中最常用的Cas9来自化脓性链球菌（SpCas9），识别NGG型PAM。虽然这个PAM序列广泛分布在植物基因组之间，但它并不能覆盖完整的基因组。新的Cas9变体和新型RNA引导的核酸酶扩大了PAM序列的多样性：

·         StCas9与 SaCas9：需要长的PAM，可能会增加靶向特异性【8,9】；

·        CRISPR–Cpf1：Cas9切割双链DNA，产生平末端的DSB，而Cpf1交错切割产生具有5'突出端；产生大的 indels，脱靶效率低【10-12】。

精确基因编辑

Fig.2 精确基因编辑

响应DSB的主要修复途径是NHEJ，通常倾向于产生导致基因功能丧失的indel。相比之下，HR导致序列改变或序列替代。 HR可以增加功能点突变，在遗传学研究中很有用，用于阐明基因功能。许多重要的农艺学特征就是基因编码区的点突变产生的结果如乙酰乳酸合酶（ALS）基因，其赋予除草剂抗性【13】。虽然在稻米和玉米中使用CRISPR-Cas9有成功的基因替换实例，HR的低效率，阻止其在植物细胞中的广泛应用：

·        病毒携带的CRISPR–Cas9-DNA修复模板：在烟草，西红柿，土豆，小麦及水稻验证过【14-18】，不会整合到基因组里面，有更大的宿主范围，尤其对于那些很难转染的植物；

·        位点特异的基因片段替换：这种位点特异的替换完全可以遗传，适用于含有内含子的基因【19】；

·        Cas9–D10A-APOBEC1/UGI :APOBEC1可以使C转化为T，Cas9 是突变形式的，不能切割，故这种方法可以行使定点突变；这种方法比较局限，如果一个区域含有多个C，会引起很多的点突变，应用起来有一定的限制，所以这种技术还是得继续改进。

展望

总的来说，减少脱靶效率，提高或者是改进植物的转化效率，精确的基因编辑是未来在植物基因编辑的主流方向。

原文链接 

https://www.nature.com/articles/nplants2017107

参考文献

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